Различные ферменты давно и достаточно широко используются в медицинской практике для энзимодиагностики, энзимотерапии, в медицинских технологиях и промышленности. Микробиологический синтез ферментов имеет ряд преимуществ, таких как неограниченность источников получения БАВ, возможность экзогенной регуляции, отсутствие прионов. Среди протеолитических ферментов особое внимание привлекает коллагеназа – эндопептидаза, расщепляющая тройную спираль молекулы нерастворимого природного белка коллагена [1]. Коллагеназа может найти широкое применение во многих областях медицины [2-6]: в хирургии, терапии, гинекологии, стоматологии, а также в косметологии (антивозрастные средства). В связи с этим поиск новых продуцентов остается достаточно актуальной задачей. Ранее нами были разработаны подходы, позволяющие осуществлять поиск продуцентов коллагеназ и разработать методы их выделения [7, 8]. Использование при скрининге модифицированных субстратов, обладающих повышенной устойчивостью к протеолизу, является дополнительным критерием при отборе потенциальных продуцентов [9]. Целью настоящей работы являлась оценка коллагенолитической активности ранее не изученных микромицетов с использованием модифицированного и немодифицированного коллагена.

Культуры Aspergillus niger F 51, Cladosporium herbarum F 33, Monilia implicata F 15, Penicillium claviforme F 32 и Phialophora verrucosa F 12 выращивали на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека следующего состава (%): NaNO₃ – 0,2; KH₂PO₄  — 0,1; MgSO₄ x 7H₂О – 0,05; KCl – 0,05; FeSO₄x 7H₂O – 0,001; CaCO₃ – 0,3; сахароза – 2; агар – 2, (рН 6,8) в течение 7-ми суток в термостате при 26⁰С. Для проведения поверхностного культивирования использовали агаризованные среды, содержащие солевой фон среды Чапека с заменой сахарозы на 2% нативного и модифицированного коллагена, полученного так, как это было описано нами ранее [9]. Протеолитическую способность микроорганизма оценивали по диаметру колоний на соответствующих субстратах после посева микромицета на агаризованную среду. Активность биосинтеза ферментов оценивали по индексу лизиса (I лиз): I лиз = D²лиз /D²кол, где Dлиз – диаметр зоны лизиса, Dкол – диаметр колонии.

Известно, что рост микроорганизмов на субстратах, содержащих белки в качестве единственного энергетического источника, позволяет судить об их потенциальной протеолитической активности. Появление зон лизиса белков вокруг колоний является показателем секреции ферментов в окружающую среду. В связи с этим на первом этапе исследования фиксировались диаметры колоний и диаметры зон лизиса при культивировании микромицетов на средах с заменой сахарозы на коллаген или модифицированный коллаген (табл. 1).

Таблица 1

Параметры роста микромицетов при поверхностном культивировании на средах с нативным и модифицированным коллагеном

Примечание. Здесь и в таблицt 2 использованы следующие обозначения: Dк – диаметр колоний; Dл – диаметр зон лизиса; кн – нативный коллаген; км – модифицированный коллаген.

Культура A. niger F 51 росла значительно медленнее на среде, содержащей модифицированный коллаген, особенно на начальных этапах роста, значительно позднее начали образовываться и зоны лизиса. При этом диаметр зон лизиса при культивировании на модифицированном субстрате был меньше в 1,5 – 1.7 раза. Скорости роста культуры P. claviforme F 32 на средах, содержащих модифицированный и нативный коллаген, отличались примерно в такой же степени, как и в случае первой культуры.

Аналогичные закономерности наблюдались и при культивировании Ph. verrucosa F 12. При этом зоны лизиса на модифицированном субстрате образовывались на сутки позднее, и их размер был меньше зон лизиса на нативном коллагене в 1,2 – 1,4 раза. Однако необходимо отметить, что размер колоний при росте на обеих средах у этой культуры был наибольшим среди других исследованных дейтеромицетов.

Очень небольшие различия размеров зон лизиса при росте на модифицированных и немодифицированных средах, отмечались и при культивировании C. herbarum F 33. В некоторых случаях диаметры зон лизиса на модифицированном коллагене были сравнимы с теми же показателями, что и при росте на нативном. Кроме того, образование зон лизиса на модифицированной среде начиналось на более ранних сроках (4 сутки культивирования), чем у всех остальных культур.

Наибольшие различия при росте на указанных субстратах наблюдались у культуры M. implicate F 15. Зоны лизиса на модифицированном коллагене отсутствовали на всех этапах культивирования. При этом был значительно замедлен и рост колоний, особенно на начальных этапах.

Cкорость роста микроорганизмов в процессе культивировании на различных субстратах во многом определяет их адаптационный потенциал. В связи с этим нами исследовалось изменение средней за все время культивирования скорости роста для 5 видов изучаемых микромицетов при замене нативного коллагена на модифицированный (рис. 1). На нативном коллагене наибольшие скорости роста отмечались у Ph. verrucosa F 12 и M. implicata F 15и составляли 4,94 и 4,86 мм/сутки соответственно. Однако скорости роста и других культур были не на много ниже и лежали в диапазоне 4,18 – 3,52 мм/сутки

Рисунок 1. Средняя скорость радиального роста микромицетов на средах с разными белками

При использовании модифицированного, более устойчивого к протеолизу белка в среде у всех грибов, кроме A. niger F 51 наблюдалось снижение скорости роста, наибольшее у M. implicata F 15 в 2,4 раза. У трех других грибов снижение скорости было менее выражено и составляло 1,2 – 1,4 раза.

Индекс лизиса является интегральным показателем, который характеризует способности культуры секретировать ферменты, гидролизующие соответствующий субстрат. Указанный показатель определяется соотношением площади колонии и площади зоны лизиса и пропорционален удельной протеолитической активности культуры, так как площадь колонии пропорциональна ее биомассе, а площадь зоны лизиса – активности секретируемых протеиназ. В связи с этим на следующем этапе исследования были рассчитаны индексы лизиса микромицетов при росте на средах, содержащих нативный и модифицированный коллаген (табл. 2).

В процессе проведенного исследования выявлено, что у всех микромицетов индексы лизиса были существенно ниже при росте на модифицированном белке и регистрировались на более поздних этапах культивирования. При этом у M. implicata отсутствовали видимые зоны лизиса на модифицированном коллагене, и индексы лизиса на нативном субстрате были очень небольшими.

Таблица 2

Индексы лизиса микромицетов при росте на средах с нативным и модифицированным коллагеном

Наибольший индекс лизиса при росте на нативном коллагене зафиксирован у A niger. Относительно высокий индекс лизиса отмечался также у P. claviforme и C. herbarum. При росте на средах с нативным коллагеном индекс лизиса превышал указанный показатель у двух других микромицетов на 7 сутки культивирования в 1,8 — 3,0 раза. При росте на модифицированном белке индекс лизиса менялся в значительно более узком интервале от 1,0 до 1,9. Средние индексы лизиса, рассчитанные за все время культивирования, менялись в следующем ряду: A.niger > C. herbarum > P. claviforme > Ph. verrucosa > M. implicata при росте на среде с нативным коллагеном и — C. herbarum > A.niger = P.claviforme > Ph. verrucosa > M. implicata – на средах с модифицированным коллагеном.

Комплексное изучение диаметров колоний, зон лизиса и индексов лизиса при поверхностном культивировании 5 микромицетов, относящихся к разным родам, на средах с нативным и модифицированным коллагеном показало, что наибольшим протеолитическим потенциалом обладают культуры Aspergillus niger F 51, Cladosporium herbarum F 33 и Penicillium claviforme F 32. Указанные культуры перспективны для дальнейшего изучения в качестве продуцентов коллагеназ.